以往《最後的晚餐》刻意渲染哀痛氣氛，眾門徒各自陷入沉思，猶大遠離眾人，彷彿他的罪行已經確定。但達文西獨具匠心，選擇了耶穌用餐時，宣布座中有人要出賣祂、眾門徒大為震驚的那一刻。在耶穌右邊的一組中，我們看到一個黑暗的面容，他朝後倚著，仿佛從耶穌面前往後退縮似的。
他的肘部擱在餐桌上，手裏抓著一只錢袋，我們知道他就是那個叛徒猶大。猶大手中的錢袋是他的象徵，這使我們想起，他就是為耶穌和其他門徒保管錢財的人，錢袋裏裝著出賣耶穌得來的三十塊銀幣的賞錢。即使他沒有拿著那只錢袋，我們也能通過達文西的繪畫方式，辨別出這個罪惡的敵人猶大。
猶大的側面陰影旁是彼得，我們也可以看見他一頭銀絲與一副白晰的手，他向年輕的約翰靠去。彼得垂在臀部的右手握著一把刀，仿佛在偶然中，刀尖對著猶大的背後。約翰的頭朝彼得垂著，在所有門徒中，他是耶穌最喜愛的一個。約翰像耶穌那樣平靜，他已經領悟了他主人的話。耶穌左邊是小雅各，他力圖去理解他所聽到的可怕的話，他兩手攤得大大的驚叫了起來。
從小雅各的肩上望去，我們看到了托馬斯，疑惑不解的托馬斯，他懷疑的神色通過他豎起的手指表現出來。小雅各的另一邊，菲利普往耶穌靠去，雙手放在胸前似乎在說︰”你知道我的心，你知道我是永遠不會出賣你的”，他的臉由於愛和忠誠而顯出苦惱的神情。圍著耶穌的這六個門徒，處於故事發生的中心。巴塞洛繆與老雅各的身體向他們傾著，而他們身旁的老安德魯並沒有站起來，但他想聽聽，於是便舉起手似乎要求安靜。右邊的三個門徒，他們正在討論有關耶穌說的那句話，他們的手指也指向餐桌的中央。他們所看到的這一切，均發生在這幅偉大的作品之中，但每次當我們欣賞它時，都會從門徒的感情與性格中獲得新的含義。
達文西完成這件作品之前，修道院院長不理解藝術家有整日思索的習慣，頻頻到場催促。達文西斷然拒絕加 快工作速度，令院長十分憤怒，告到公爵面前，公爵召來藝術家，要求說明。達文西解釋說，像他這樣的一些「天才」，有時看似清閒，實際上正忙得很，因為他需要「冥思苦想，完善各種構思」，然後動手實現。無論如何，只剩耶穌和猶大的兩尊頭像暫付闕如。達文西自認，除非天上賜他靈感，否則，很難完成耶穌的頭像，而對猶大這種卑鄙的叛賣者，物色合適的頭像同樣需要時日。不過，為了早日完工，他可以勉為其難，用頭腦簡單的院長的尊容來充數，這使公爵也忍俊不住。
達文西對這幅壁畫的人物心理變化之掌握極為傳神而複雜，在此之前，從沒有畫家為人物的表現而去研究人類的心理；所以達文西被視為是這種新觀念的創始人，為世人證實「藝術家也可以是沈思與創造的思想家，與哲學家沒有兩樣」的新觀念。
